Průnik adenylát-cyklázového toxinu (ACT) do leukocytů je unikátním příkladem translokace toxického bakteriálního enzymu (AC) přes plazmatickou membránu cílové buňky. Jeho detailní popis má značný význam také pro pochopení obecných mechanismů interakce proteinů s biologickými membránami. Navážeme na předchozí identifikaci funkčních domén ACT a připravíme sadu specifických mutant blokovaných v jednotlivých krocích interakce ACT s buňkou, které využijeme k identifikaci struktur toxinu účastnících se vazby na buněčný integrinový receptor CD11b. Pomocí biochemických, molekulárně-biologických a biofyzikálních přístupů pak definujeme molekulární mechanismy interakce ACT s membránou a translokace AC domény do buněk. Stanovíme stupeň oligomerizace a membránovou topologii ACT a určíme úlohu kation-selektivních kanálů ACT v mobilizaci vápníku do buněk. Z těchto analýz posléze vyvodíme vztah mezi strukturou ACT, součinností jeho membránových aktivit a kapacitou ACT indukovat apoptózu leukocytů. (cs)
Penetration of adenylate cyclase toxin (ACT) into target cells is a unique example of direct translocation of a toxic enzyme across the target cytoplasmic membrane. Its understanding is, hence, of general relevance for deciphering the principles of membrane interactions of proteins. We will tie-up on identification of functional domains of ACT and use a set of ACT mutants selectively blocked in the individual steps of ACT interaction with cells, in order to define the molecular mechanisms underlying membrane insertion and translocation of ACT. Structures involved in binding of ACT to the CD11b integrin receptor will be defined and the oligomeric status, membrane topology, mechanism of formation and signaling role of ACT channels in calcium mobilization into cells will be determined by an array of biochemical, molecular biology and biophysical approaches. The relationship between ACT structure and membrane activities and induction of leukocyte apoptosis will be deduced. (en)